隨著類器官技術(shù)的進(jìn)步，腦類器官在研究人類大腦發(fā)育、腦疾病建模和開發(fā)新藥方面顯示出巨大的潛力，腦類器官對于研究和模擬人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病至關(guān)重要。然而，腦類器官的培養(yǎng)周期長，成本高，極大限制了它們在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。攜帶病理特征的新鮮人腦組織是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病更為可靠的模型。目前，具有特定病理特征的腦組織可獲取性，可操縱性以及低溫保存神經(jīng)活性都面臨很多技術(shù)難題。冷凍保存技術(shù)已在胚胎干細(xì)胞、配子、胚胎、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤類器官、子宮內(nèi)膜器官等方面廣泛應(yīng)用，極大助力再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。腦類器官/腦組織是由多種神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，具有神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)活動，二維細(xì)胞和非神經(jīng)類器官的冷凍方法不適用于神經(jīng)類器官和人腦組織。因此，迫切低需要開發(fā)腦類器官/腦組織的低溫保存方法，對推動腦科學(xué)基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究具有十分重要的意義。

2024年5月13號，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院邵志成研究員團(tuán)隊在Cell Reports Methods雜志在線發(fā)表了題為【Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids】的研究論文，報道了一種被稱為 MEDY 的全新腦類器官冷凍保存新技術(shù)，該技術(shù)在冷凍過程中能夠保留腦類器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能活性，保留人腦組織的病理特征。MEDY將能夠大規(guī)模、可靠地存儲各種神經(jīng)類器官和腦組織，促進(jìn)多種神經(jīng)類器官在基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用和藥物篩選中的廣泛應(yīng)用，對將來真正實(shí)現(xiàn)完整人腦的冷凍保存起到一定的推動作用。

研究團(tuán)隊首先選擇了多種在維持類器官形態(tài)完整性、減少神經(jīng)元死亡和保護(hù)軸突生長過程中起作用的試劑，包括甲基纖維素（Methylcellulose）、乙二醇（Ethylene glycol）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖（Trehalose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）和脯氨酸（Proline）等，通過不同濃度梯度，初步篩選出對類器官有一定保護(hù)作用的試劑甲基纖維素、乙二醇和 PVP 作為低溫保存介質(zhì)組分的候選試劑。為了進(jìn)一步提高冷凍保存的效率，研究團(tuán)隊測試了不同冷凍保存介質(zhì)組合并添加 ROCK 抑制劑 Y27632 后對類器官的凍存保護(hù)效果進(jìn)行檢測，結(jié)果表明 4 種組合冷凍劑都極顯著地解決了類器官復(fù)蘇后出現(xiàn)大量碎片的問題。通過對復(fù)蘇后類器官軸突生長狀態(tài)、神經(jīng)元生長狀態(tài)以及凋亡比例的對比分析，最終確定了 1% 甲基纖維素+10% 乙二醇+10% DMSO+10 μM Y27632（MEDY）作為腦類器官的最佳冷凍保存劑。

進(jìn)一步，通過改進(jìn)復(fù)溫流程，以及復(fù)蘇后ROCK抑制劑預(yù)處理步驟，最終建立了腦類器官凍存復(fù)蘇新方法。改進(jìn)方法復(fù)蘇后的神經(jīng)類器官保留了細(xì)胞多樣性、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)元功能活性。

研究團(tuán)隊首先選擇了多種在維持類器官形態(tài)完整性、減少神經(jīng)元死亡和保護(hù)軸突生長過程中起作用的試劑，包括甲基纖維素（Methylcellulose）、乙二醇（Ethylene glycol）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖（Trehalose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）和脯氨酸（Proline）等，通過不同濃度梯度，初步篩選出對類器官有一定保護(hù)作用的試劑甲基纖維素、乙二醇和 PVP 作為低溫保存介質(zhì)組分的候選試劑。為了進(jìn)一步提高冷凍保存的效率，研究團(tuán)隊測試了不同冷凍保存介質(zhì)組合并添加 ROCK 抑制劑 Y27632 后對類器官的凍存保護(hù)效果進(jìn)行檢測，結(jié)果表明 4 種組合冷凍劑都極顯著地解決了類器官復(fù)蘇后出現(xiàn)大量碎片的問題。通過對復(fù)蘇后類器官軸突生長狀態(tài)、神經(jīng)元生長狀態(tài)以及凋亡比例的對比分析，最終確定了 1% 甲基纖維素+10% 乙二醇+10% DMSO+10 μM Y27632（MEDY）作為腦類器官的最佳冷凍保存劑。

進(jìn)一步，通過改進(jìn)復(fù)溫流程，以及復(fù)蘇后ROCK抑制劑處理步驟，最終建立了腦類器官凍存復(fù)蘇新方法。改進(jìn)方法復(fù)蘇后的神經(jīng)類器官保留了細(xì)胞多樣性、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)元功能活性。

然后，研究團(tuán)隊將長期培養(yǎng)的大尺度腦類器官進(jìn)行 MEDY 冷凍復(fù)蘇，發(fā)現(xiàn)其對成熟的類器官依然起到冷凍保護(hù)作用。此外，該 MEDY 技術(shù)可以更廣泛地應(yīng)用于多種腦區(qū)域特異性類器官，包括背/腹側(cè)腦、脊髓、視神經(jīng)類器官和癲癇患者源性腦類器官。同時，MEDY 可用于 3D 人腦組織的低溫保存，解凍后仍可保留其病理特征。最后，研究團(tuán)隊通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MEDY 通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑從而保護(hù)突觸功能，實(shí)現(xiàn)在低溫狀態(tài)下對腦類器官的保護(hù)作用。

綜上所述，該研究能夠在將來顯著減少了神經(jīng)類器官的制備時間和成本，并能維持活體人腦組織的病理特征，便于各種神經(jīng)類器官和活體腦組織的大規(guī)模存儲，促進(jìn)腦科學(xué)基礎(chǔ)研究、神經(jīng)類移植器官治療和藥物評估與篩選。

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