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    CHO-K1倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株的培養(yǎng)方法

    發(fā)布時(shí)間： 2024-04-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 609次

    中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細(xì)胞是第一個(gè)被美國(guó)FDA、歐盟EMA和中國(guó)CFDA認(rèn)可的用于生物制藥領(lǐng)域的生產(chǎn)細(xì)胞，已廣泛應(yīng)用于各種治療性蛋白質(zhì)藥物的大規(guī)模制備，包括重組抗體、重組單體蛋白質(zhì)以及重組融合蛋白質(zhì)等。CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細(xì)胞。最原始的CHO-K1細(xì)胞是貼壁培養(yǎng)，并需要添加血清，由于血清的批間穩(wěn)定性問題，及后來病毒安全性問題，無血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)室常以貼壁的CHO K1細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

     

                                    圖片


    細(xì)胞形態(tài)：長(zhǎng)梭形（10×倍鏡）
    培養(yǎng)條件：DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清終濃度為10%
    培養(yǎng)溫度：37°C

    細(xì)胞復(fù)蘇：


    1.在攝氏37度的水浴中輕輕攪動(dòng)，為防止受到污染，不要把O形環(huán)和蓋子放在外面。解凍應(yīng)迅速（約2分鐘）。
    2.解凍后把凍存管盡快從水中拿出來，用75% 乙醇浸泡或噴灑消毒乙醇。從現(xiàn)在開始所有的操作都應(yīng)該進(jìn)行在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行。
    3.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有9 ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基的離心管中，10000 rpm離心5分鐘。
    4.棄上清，用（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
    注意：在T25瓶加入細(xì)胞之前，可以先將包含（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基的容器放入培養(yǎng)箱內(nèi)至少15分鐘，以便培養(yǎng)基達(dá)到正常PH（7.0至7.6）。
    5.將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。


    細(xì)胞傳代：


    1.棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍細(xì)胞層，以消除所有痕量的血清。
    2.加入2.0 ~ 3.0 mL  0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞直到細(xì)胞層分散。
    注意：為了避免結(jié)塊，請(qǐng)不要通過擊打或搖晃瓶子。可在37℃培養(yǎng)箱等待細(xì)胞，加快細(xì)胞分散的速度。
    3.加入6 - 8 mL的（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化并反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至離心管，1000 rpm 5 min。
    注意：（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基里有血清，血清里過量的血清蛋白與胰酶結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使胰酶無法繼續(xù)消化細(xì)胞。
    4.  棄上清，添加新的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中添加適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液，并補(bǔ)充新鮮（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基。
    5. 將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
    注意：ATCC建議傳代比例為：1:4至1:8。


    細(xì)胞凍存：


    1.當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
    注意：常見的細(xì)胞凍存密度是1-10*10^6 cells/mL。
    2.棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍細(xì)胞層，以消除所有痕量的血清和細(xì)胞生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的廢料。
    3.加入2.0 ~ 3.0 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞直到細(xì)胞層分散。
    4.加入適量的（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，槍頭反復(fù)吹打混勻后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000 rpm 5 min。
    5.棄上清，依次加入700 μL培養(yǎng)基，200 μL胎牛血清重懸細(xì)胞，最后添加 10% DMSO 后梯度降溫凍存。

    注意：DMSO加到細(xì)胞里會(huì)迅速放熱，對(duì)細(xì)胞活力造成損傷，因此可以選擇在最后一步添加，加完迅速轉(zhuǎn)移至低溫。

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