血管生長是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。通過抑制腫瘤血管生成來阻止腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移合乎邏輯。

      血管生成(angiogenesis)是生殖、生長發(fā)育和修復(fù)的基礎(chǔ)。腫瘤無新生血管時,直徑很少超過2 mm-3 mm,其生長處于休眠狀態(tài)。當(dāng)腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶長大到一定程度,氧及營養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的排出就出現(xiàn)不足。一旦血管長入腫瘤,供給腫瘤組織營養(yǎng)和氧的方式由周邊彌散變成血液灌注,其代謝產(chǎn)物也能在血液循環(huán)時徹-底清除。腫瘤血管不僅為腫瘤提供營養(yǎng)和氧,運走代謝產(chǎn)物,還決定腫瘤的病理生理、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和對各種治療的反應(yīng) 。該觀點于1971年經(jīng)Folkman梳理,加之隨后血管生長因子被發(fā)現(xiàn),這個問題受到學(xué)術(shù)界極大重視,相關(guān)藥物研究也隨之蓬勃發(fā)展。

      腫瘤血管生成包括了以下五種方式 。血管生成 (angiogenesis)即腫瘤組織在原有微血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上通 過“芽生"方式形成新血管;血管發(fā)生(vasculogenesis) 即血液或骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞形成新血管;血管套疊 (intussusception)即間質(zhì)組織摻入到已有的血管參與腫瘤血管的構(gòu)成;馬賽克血管(mosaic vessel)即內(nèi)皮細胞和分散的腫瘤細胞本身相間排列組成血管;血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry)即腫瘤細胞模擬并取代內(nèi)皮細胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)。 

      體外的血管形成實驗成為研究的熱點，目前血管形成實驗一般都采用內(nèi)皮細胞結(jié)合條件培養(yǎng)基或結(jié)合腫瘤細胞并接種于基底上就形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，觀察其形成的結(jié)構(gòu)，之后通過各種軟件進行定量分析。目前做的比較多的是內(nèi)皮的小管形成：

1. 內(nèi)皮的代數(shù)不能太多，若是HUVEC ，HMEC-1等細胞系去做此類的實驗，建議細胞的代次控制在7代內(nèi)，若細胞形態(tài)不好，與鋪板成管的關(guān)系會很大，所以在做實驗時，一定要在細胞具有最佳生長狀態(tài)，最佳形態(tài)，并且無任何污染的情況下鋪板，細胞盡量鋪勻，要不然做出來的小管可能會存在斷點。

2. 原代內(nèi)皮細胞做小管實驗，因為內(nèi)皮細胞分離并不是想象中的剝下來就是內(nèi)皮的那么簡單，比如Cell Systems的原代細胞分離的標準就有很具體的說明，細胞在P0的時候，基本是有雜質(zhì)的，然后需要進行磁珠篩選或者酶消化一次，（cell systems的細胞為了讓科研用戶的實驗更不受抗體影響，一般不采用抗體篩選，這樣原代細胞在純化之后不會帶任何抗性，影響實驗最終的結(jié)果）所以原代的內(nèi)皮在做小管實驗的時候盡量控制傳代的次數(shù)，最好做一個傳代的極限測試，然后再根據(jù)結(jié)果復(fù)蘇細胞進行實驗。

3. 鋪板基質(zhì)膠的時候一定要注意：感覺這個玩意一定要好的品牌，好的品牌還挺貴的，所以不能浪費，鋪膠前可以用無血清的培養(yǎng)基先稀釋，一般是1：2左右；（建議不稀釋用的心痛，稀釋太大怕成不了管的心理的同學(xué)可以嘗試一下）膠一個96 孔板一般是50ul左右，土豪可以試試24孔板鋪膠，相比下來面積更大，拍照的地兒也多，可以各種POSE擺起來，大佬可以試試血管生成的培養(yǎng)皿，這玩意簡單省事，直接把細胞往上一蓋，坐等美圖自動生成。

需要注意的點：配制試劑時，不要產(chǎn)生氣泡；加細胞懸液時，不要讓槍頭觸碰基質(zhì)膠，

4. 鋪細胞的密度要控制好，狀態(tài)和密度息息相關(guān)，若當(dāng)心細胞不成管可以給它來點生長因子如EGF,VEGF等。

5. 拍照的時間一定要掌握好，千萬不能睡過頭，一般內(nèi)皮細胞在鋪板后12小時開始成管，24小時后開始崩解；

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