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    補體介導(dǎo)法

    發(fā)布時間： 2022-03-11　　點擊次數(shù)： 1016次

    原理


    帶有特異抗原的靶細(xì)胞（如正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補體的參與下，引起靶細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加、細(xì)胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍(lán)）可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞著色，故可用于指示死細(xì)胞或瀕死細(xì)胞，而活細(xì)胞不著色。此即補體依賴性細(xì)胞毒試驗，利用細(xì)胞毒試驗可以檢查細(xì)胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。
     
    本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細(xì)胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用，可殺傷95%以上的胸腺細(xì)胞。
     


    材料與儀器

    C57BL／6J小鼠
    Hank’s液 單克隆抗體 補體 伊紅-Y染液
    眼科剪 眼科鑷 平皿 不銹鋼網(wǎng) 試管 吸量管 尖吸管 載玻片 蓋玻片 顯微鏡

    步驟


    一、實驗方法
     
    1.  小鼠胸腺細(xì)胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后，過篩，放入試管，離心1 000 rpm，5分鐘，用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細(xì)胞重懸于Hank’s液中，配成1×107/ml細(xì)胞懸液。
     
    2.  取試管3支，標(biāo)明順序，依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細(xì)胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分鐘。
     
    3.  取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴，混勻，室溫放置2分鐘。
     
    4.  重新混勻后分別在一張載玻片上滴片，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察，比較3管中細(xì)胞死活情況。
     
    二、實驗結(jié)果
     
    死細(xì)胞呈紅色，無光澤且腫脹變大；活細(xì)胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。
     
    高倍鏡下計數(shù)200個細(xì)胞并計算其中死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。計算公式如下：死細(xì)胞百分?jǐn)?shù)= EQ EQ \F(實驗管死細(xì)胞數(shù)%-對照管死細(xì)胞數(shù)%，100%-對照管死細(xì)胞數(shù)%)


    注意事項


    1.  胸腺細(xì)胞制備速度要快，且需在冰浴中進(jìn)行操作，以保持細(xì)胞活力；
     
    2.  抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預(yù)實驗中確定；
     
    3.  細(xì)胞對照管死細(xì)胞數(shù)若超過5%，實驗需重新做；
     
    4.  細(xì)胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。


    常見問題


    一、實驗材料
     
    1.  解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80～100目不銹鋼網(wǎng)；
     
    2.  試管、1 ml吸量管、尖吸管；
     
    3.  載玻片、蓋玻片；
     
    4.  C57BL/6J小鼠；
     
    5.  含5%NBS的冷Hank’s液；
     
    6.  抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（最適稀釋度，本室制備）；
     
    7.  補體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細(xì)胞吸收，預(yù)先測定效價并稀釋為最佳稀釋度)；
     
    8.  1%伊紅-Y染液。

    二、多重PCR的特點


    1.高效性


    在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。


    2.系統(tǒng)性


    多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時偵檢。


    3.經(jīng)濟(jì)簡便性


    多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。


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