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您的細胞準備好“開學”了嗎？
發布時間： 2022-02-28 點擊次數： 1300次各位老師在進行細胞培養時，肯定會遇到以下問題： 細胞越長越多 買的細胞比較貴重 節假日無法照看細胞 實驗不順暢需要重新進行實驗
這時，我們就需要適當的保存一些細胞，也就是凍存細胞。 細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。
利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。
在不加任何保護劑的條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。 如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。 放假前大家進行細胞凍存，安心過個好年，那么接下來 您的細胞準備好“開學"了嗎？ 細胞凍存復蘇遵循的原則是：慢凍快融 今天我們來聊聊，細胞復蘇時需要注意的那些事兒。 細胞復蘇的原則：快速融化 必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。 01
實驗前準備
將水浴鍋提前預熱至37℃
細胞實驗室進行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。
02
取出凍存管
根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。
從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
03
迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
約1-2min后凍存管內液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。
04
平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min?離心3分鐘。
05
制備細胞懸液
吸棄上清液。
向離心管內加入10ml*培養液，吹打制成細胞懸液。
用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放入培養箱中培養。
06
細胞計數
細胞濃度以5×105/ml為宜。
07
培養細胞
將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃，5％CO2的培養箱內2-4h（或者24-48h）后換液繼續培養培養，換液的時間根據細胞情況而定。
08
記錄復蘇日期
“ Note
注意事項
細胞凍存和復蘇是細胞培養技術里面最容易出現問題的部分，因此我們幫您總結以下幾點注意事項，幫助您更好的進行實驗操作： 注意無菌操作。 取細胞的過程中可能會接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護目鏡。 ☆此項尤為重要，如果凍存管密封不嚴，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸，所以，一定要戴保護眼鏡和手套。 應在1-2min內使凍存液*融化。如果復溫速度太慢，則會造成細胞損傷。另外，細胞復蘇后的操作最好在4℃冰浴中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。 細胞復蘇過程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃水箱中取出的細胞在最短的時間內放入水浴鍋中進行解凍。 離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少其對細胞的損傷。 細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15ml培養液，經驗總結，培養基越少細胞越容易貼附。 復蘇細胞分裝的問題：復蘇1管細胞一般根據情況可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。 加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果加培養基的太少，DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響。還有一個說法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。
初學者易犯錯誤
水浴鍋未提前預熱或者未預熱到37℃直接融化。 水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。 離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。 一次復蘇細胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經熟悉了的生長環境。突然使用不一樣的培養液和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡，像水土不服一樣。 結果分析
判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。
如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。
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