Q：剛收到細胞，顯微鏡觀察細胞成片漂浮，該如何處理？

可能是消化過度導致了部分細胞的細胞膜受損、凋亡，部分細胞膜受到破壞，導致細胞生長緩慢。若細胞形態有明顯變化，且細胞表面有明顯黑點，間隙間也有較多黑點，可能是支原體污染，建議空培養細胞培養基，觀察黑點是否會增殖。

若還有保種細胞，請復蘇靠前代次，并注意觀察拍照，有任何問題可以及時聯系我司銷售處理售后（需提供細胞圖片）。

凍管到貨時的剩余干冰情況、收貨后的保存情況、使用的血清、培養基以及復蘇操作不當等原因都可能影響細胞復蘇情況。

貼壁細胞：

若復蘇時離心，建議48h后換液，如密度達到10%，則繼續按說明書正常操作培養；若復蘇時沒有離心，建議收集懸浮細胞后重新接種。若細胞依然無貼壁增殖，請及時反饋銷售處。

懸浮細胞：

建議復蘇48小時后觀察拍照，若培養基沒有變色，部分細胞仍然比較圓潤，可繼續放置培養后48小時拍照。若細胞全部皺縮，請及時聯系銷售處理售后。

可能原因如下：

1. 沒有及時換液，導致培養基酸度增強、營養成分降低時會出現細胞胞漿產生及空泡；

2. 沒有及時傳代，細胞生長過密，少數細胞開始在鋪滿的第一層細胞上生長。很多細胞開始漂浮時，也有部分細胞出現空泡變性；

3. 若密度很低，則細胞密度提高會有所改善，可以提高血清濃度或更換質量更好的血清。若密度高，請及時更換培養基，注意培養基添加量和換液情況，保證細胞有足夠營養。

細胞消化時間一般在2~3min，消化期間請不要晃動培養瓶，部分細胞需要延長消化時間，或用PBS清洗2次，吸干凈瓶里殘留的PBS后用少量胰酶潤洗，再次添加1ml胰酶進行二次消化。

消化時放入培養箱，2~3分鐘后取出，用手掌心拍打瓶尾觀察細胞脫落情況，如沒有細胞脫落則繼續放培養箱。如果消化5分鐘也沒有脫落或只有輕微細胞脫落，可以繼續放培養箱，或把消化下來的細胞收集終止消化后，將培養瓶內的細胞繼續添加1~2ml胰酶繼續消化。

當細胞有80%左右脫落且成單個細胞后，可終止消化，用吸管吹打瓶里各部位4~8次，盡量用吸管不用槍頭，不要吹出氣泡，然后收集懸液進行離心。

剛收到的細胞如更換了培養基或血清，會存在變形的情況，屬正常情況，需要一定的適應過程。當體外培養時間增長后，隨著傳代次數的增多，細胞形態也會有觸角、拉絲、變瘦等變化，可能與消化時間和培養條件有關。

可能原因如下：

1. 可能是棉球纖維、凋亡細胞片、血清蛋白，或一些無血清培養基添加因子后的因子析出物，屬于正常現象；

2. 如果是傳代后細胞堆積成團，肉眼可見白色點狀物，則是消化沒有吹散開或消化過度導致的細胞抱團自救，建議在細胞密度變高后改善消化過程。

消化過度可能導致部分細胞的細胞膜受損、凋亡，導致細胞生長緩慢。可以用PBS洗掉凋亡細胞后，提高一定血清濃度培養，并且改善消化時間。

· 細菌污染

細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，鏡下可見黑色的到處亂跑的黑點。細胞一旦出現細菌污染，爆發會很快，培養基很快會出現渾濁，且細胞狀態明顯變差。

· 真菌污染

一般培養液清亮不變色，鏡下有絲狀物。有些真菌開始很像死細胞碎片，只是有很多很多的小塊很清楚，呈珊瑚狀，不像細胞碎片分不清，慢慢會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發現。

實驗室較典型的污染真菌是白色念珠菌，它存在于人的口腔和生呼吸道等處。

· 霉菌污染

培養基是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質。在37度孵箱中培養2~3天，仍清亮，但出現絮狀雜質，鏡下可見明顯菌絲。長時間后，細胞雖然仍可生長，但活力狀態變差。

· 支原體污染

支原體為黑色小點，培養基一般會渾濁。支原體感染細胞后，細胞病變不明顯，只是慢慢死亡。